混合文库唯一的限制是可用条码的数量。当然您还应该考虑样本的细胞数量和覆盖该样本所需的读取数。
Illumina平台你可以将最多40个（人TCRβ 60个）不同条码标记的样本混合于同一个测序通道中。然而我们建议Roche平台每个测序通道混合样本数量不超过5个。

不能，第一轮PCR不能产生足够的扩增产物。需要第二轮PCR扩增才能产生足够的文库产物来显示和测序。

我们在实验室使用溴化乙锭，没有使用过凝胶红。但我们不认为这会有什么问题，建议您联系正在使用的胶回收试剂供应商进行咨询。

可以

在用iRepertoire引物进行第二轮扩增后，Ilumina测序接头A与C基因或J基因的扩增子相结合，而接头B与V基因的扩增子相结合。
接头A: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’
接头B: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3’
经片段选择之后，纯化的产物可直接进行簇生成，而不需要进一步扩增，因为Illumina双末端测序接头已全部连接到V(D)J序列上。

产生的Illumina文库与双端测序兼容。事实上对于Illumina平台，我们推荐采用双端测序，因为双端读取的序列信息来自同一个DNA片段。这个信息对延长测序读长以覆盖整个CDR3区、识别V基因和J基因片段的可靠性非常有用。另外，我们可使用双端测序的信息确认CDR3片段序列的可信度。我们的数据分析通道默认所有文库为双端测序。

请遵循Illumina推荐的说明。通常在MiSeq V2 500 cycle 试剂盒，我们加载8 pM的混合文库。