测序

• Q

  可以将多少样本文库进行混合？

  A

  混合文库唯一的限制是可用条码的数量。当然您还应该考虑样本的细胞数量和覆盖该样本所需的读取数。
  Illumina平台你可以将最多40个（人TCRβ 60个）不同条码标记的样本混合于同一个测序通道中。然而我们建议Roche平台每个测序通道混合样本数量不超过5个。

• Q

  在扩增子上包含了什么Ilumina测序接头序列？

  A

  在用iRepertoire引物进行第二轮扩增后，Ilumina测序接头A与C基因或J基因的扩增子相结合，而接头B与V基因的扩增子相结合。
  接头A: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’
  接头B: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3’
  经片段选择之后，纯化的产物可直接进行簇生成，而不需要进一步扩增，因为Illumina双末端测序接头已全部连接到V(D)J序列上。

• Q

  iRepertoire引物所产生的Illumina文库是否与双端测序兼容，或者仅限于单端测序？

  A

  产生的Illumina文库与双端测序兼容。事实上对于Illumina平台，我们推荐采用双端测序，因为双端读取的序列信息来自同一个DNA片段。这个信息对延长测序读长以覆盖整个CDR3区、识别V基因和J基因片段的可靠性非常有用。另外，我们可使用双端测序的信息确认CDR3片段序列的可信度。我们的数据分析通道默认所有文库为双端测序。

• Q

  测序仪的上机浓度是多少？

  A

  请遵循Illumina推荐的说明。通常在MiSeq V2 500 cycle 试剂盒，我们加载8 pM的混合文库。

• Q

  是否可访问原始数据？

  A

  考虑同一测序通道内可能存在多个客户的文库，我们提供拆分后的数据（非原始测序数据）。如果您是独立的测序通道，可获得原始测序数据。

• Q

  在测序前我们应该做哪些QC步骤？

  A

  我们建议使用Nanodrop或类似设备检测每个文库产物的浓度，条件许可的话尽可能使用凝胶电泳或片段分析仪进行产物分析。在基于浓度信息合并文库（将不同条码标记的不同样本混合到一个测序反应）中，最重要的步骤是获得该合并文库的准确浓度。对于合并文库通常使用基于荧光强度检测的Qubit测量精确的浓度，我们也在片段分析仪上分析少量的合并文库。目前获得准确浓度的最好的方法是将合并文库产物通过Kapa qPCR进行分析，因为它能模拟流动槽的分析过程。

• Q

  你为什么推荐加入10-15%的PhiX spike ?

  A

  由于iRepertoire文库是一个靶向测序分析，本质上多样性比较低。PhiX spike-in可增加混合文库的多样性，并有利于Illumina软件准确区分单个样本文库。