与健康人群相比，各类疾病患者的免疫组库在数量或性质上可能发生变化。数量的变化可能是免疫组库多样性的增加或减少。性质的变化主要表现为在T细胞或B细胞中疾病相关特异性CDR3s的增加或减少。

优良的扩增技术是定量和定性研究免疫组库的关键。一个好的扩增方法应该是具有覆盖的全面性且能够定量的。全面覆盖意味着在一个样本中10-50万不同的CDR3s可以在一个实验中全部被扩增，定量意味着扩增过程中不会引入偏差。我们采用iRepertoire开发的多重PCR方法，可以全覆盖和定量地扩增免疫基因组。

优良的多重PCR应该具有特异性、敏感性、多重能力、定量、靶点扩增均匀、使用方便、设计开发方便、速度快、价格低等特点。iRepertoire提供了两种不同的多重PCR方法，这两种方法都扩增了样本中的所有V(D)J组合，包括高度可变的CDR3区域。通过arm-PCR(扩增子拯救多重PCR，专利7999092)，我们可以高灵敏度地从人或小鼠样本中扩增所选择肽链的所有克隆型，即使是极其罕见的克隆型。通过dam-PCR(二聚体避免多重PCR，专利正在申请中)，我们可以用比其他竞争方法更准确的定量方式同时扩增BCR和TCR的所有肽链或者任意肽链的组合。

在2009年，iRepertoire开发了新一代mPCR技术，arm-PCR (扩增子拯救多重PCR，专利号：7999092)。对于arm-PCR，在初始的PCR循环中使用了高浓度的嵌套引物。然后以第一轮扩增过程中已经引入识别共享标签的序列为模板，通过添加新的通用引物和酶，来进行第二轮的PCR检测。在mPCR中，由于扩增的指数阶段是由一对引物对所有潜在目标进行的，所以所有的CDR3s都以半定量的方式被放大。

iRepertoire的dam-PCR技术可以选择TCR和BCR肽链的任何组合，在一个反应中同时扩增。独特的单循环结合、延伸步骤和严格的清除步骤相结合，避免了引物二聚体的形成。首先，只添加3’引物，进行一次结合和延伸步骤。将未结合的3’引物洗掉，然后加入5‘引物。在另一个单一循环结合和延伸后， 5’引物被清除。添加与前两步引入的引物位点相结合的通用引物，进行多循环、指数级扩增。Dam-PCR还允许包含独特的分子标签(UMI)，这样每个RNA链都可以被标记进行直接定量，消除PCR和/或测序错误。增加了对测序目标的置信度，并且定量允许对获得性免疫组中链与链之间的比例进行研究。

因此，arm-PCR提供了对特定肽链免疫组库的包容性、半定量的描述，而dam-PCR提供了对任意组合的或所有的BCR和TCR肽链克隆型频率的定量观察。

多重PCR的常见难点：引物效率不一，靶点扩增条件不一，背景扩增，引物二聚体。

针对这些难点，我们成功的给出了解决方案：

• 覆盖全面

• 靶点扩增均匀

• 高特异性

• 高敏感性

• 可定量

• 可同时扩增多个靶点