iPair依靠iRepertoire的arm-PCR技术。在iPair中,我们使用基于流式细胞术的方法将单个细胞置于96孔的iCapture板中。我们的多重引物混合物开发用以平衡在低反应量时同一PCR孔中同时两个位点的扩增。然后,我们使用Illumina MiSeq平台和500+循环测序试剂盒对结果进行测序,这样可变区域的序列就可以被调取。
iPair一般可达到>90%的扩增成功率,我们的一体化测序组合配对成功率大于80%。
我们的单细胞表型服务,iPair+,使用专门的引物分析细胞额外的功能信息。iPair+有两种可定制选项,其中哪一种最适合您的项目,很大程度上取决于您想研究哪个表型目标,您有多少目标,以及您的预算。
基因特异性引物法是将表型靶标引物与受体V(D)J引物在同孔内共扩增。有30个基因特异性引物可供人类样本使用;小鼠样本必须用oligo-dT方法处理。
使用基因特异性引物的主要优点是经济实惠。因为所有东西都是在一个板里加工的,所以没有额外的加工费。然而,高表达的表型靶蛋白在测序过程中可能占据大量reads,导致V(D)J信号丢失。如果表型标记数量较少(~10-15个),建议采用基因特异性方法。
我们的第二种方法是基于oligo-dT的方法。oligo-dT方法的 panel包括100多个人或小鼠样本的基因靶标。在实验过程中,细胞被裂解,逆转录(RT)用oligo-dT引物进行。然后将该cDNA分开为两个板:一个用于V(D)J扩增,另一个用于表型分析。由于每个孔中的细胞都有单独的条形码,在下游数据分析时,表型数据可以和V(D)J信息结合。虽然这确实增加了成本,但它允许用户选择更多的表型目标。